ABSTRACT
RESUMO Objetivo A escassez de pulmões viáveis ainda é um grande obstáculo para o transplante. As vítimas de trauma, que constituem potenciais doadores de pulmão, comumente apresentam choque hipovolêmico que acarreta inflamação e deterioração pulmonar e rejeição após o transplante. Buscando melhorar o enxerto pulmonar, testaram-se novas abordagens ao tratamento do doador. Este estudo foca o tratamento com células-tronco mesenquimais (CTMs) ou fatores solúveis produzidos pelas CTMs (FS-CTMs), usando um modelo com ratos para doadores de pulmão após choque hemorrágico. Métodos Quarenta e oito ratos foram divididos em quatro grupos: Controle (n=12), animais sem indução de choque hipovolêmico; Choque (n=12), animais submetidos a choque hipovolêmico (pressão arterial média de 40 mmHg); CTM (n=12), animais submetidos a choque hipovolêmico e tratados com CTMs; e FS (n=12), animais submetidos a choque hipovolêmico e tratados com FS-CTMs. Os animais foram submetidos a um procedimento de choque hipovolêmico (40 mmHg) com 50 minutos de duração. Os animais tratados foram monitorados por 115 minutos. Realizamos análise histopatológica do tecido pulmonar e quantificação dos marcadores inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, iCAM e vCAM) no tecido pulmonar e leucócitos no sangue periférico (LSPs). Resultados O choque hemorrágico resultou em taxas mais altas de LSPs e infiltrado de neutrófilos nos pulmões. Os animais do grupo FS apresentaram menor densidade de neutrófilos em comparação com os animais dos grupos Choque e CTM (p<0,001). Não foram observadas diferenças entre os grupos quanto aos níveis de citocinas no tecido pulmonar. Conclusão Os pulmões dos ratos submetidos a choque hemorrágico e tratados com FS-CTM apresentaram inflamação reduzida indicada por uma diminuição do infiltrado de neutrófilos nos pulmões.
ABSTRACT Objective The shortage of viable lungs is still a major obstacle for transplantation. Trauma victims who represent potential lung donors commonly present hypovolemic shock leading to pulmonary inflammation and deterioration and rejection after transplantation. Seeking to improve lung graft, new approaches to donor treatment have been tested. This study focuses on treatment with mesenchymal stem cells (MSCs) or soluble factors produced by MSCs (FS-MSC) using a rat model for lung donors after hemorrhagic shock. Methods Forty-eight rats were divided into four groups: Sham (n=12), animals without induction of hypovolemic shock; Shock (n=12), animals submitted to hypovolemic shock (mean arterial pressure 40 mmHg); MSC (n=12), animals submitted to hypovolemic shock and treated with MSCs, and FS (n=12), animals submitted to hypovolemic shock and treated with FS-MSC. The animals were subjected to a 50-minute hypovolemic shock (40 mmHg) procedure. The treated animals were monitored for 115 minutes. We performed histopathology of lung tissue and quantification of inflammatory markers (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, iCAM and vCAM) in lung tissue and peripheral blood leukocytes (PBLs). Results Hemorrhagic shock resulted in higher PBLs and neutrophil infiltrate in the lungs. FS animals had lower neutrophil density comparing with Shock and MSC animals (p<0.001). No differences in the cytokine levels in lung tissue were observed between the groups. Conclusions The lungs of rats submitted to hemorrhagic shock and treated with FS-MSC showed reduced inflammation indicated in a decrease in lung neutrophil infiltrate.
Subject(s)
Animals , Rats , Shock, Hemorrhagic/therapy , Lung Transplantation , Mesenchymal Stem Cells , Disease Models, Animal , Inflammation , LungABSTRACT
Abstract Background: Diabetes mellitus is a severe chronic disease leading to systemic complications, including cardiovascular dysfunction. Previous cell therapy studies have obtained promising results with the use bone marrow mesenchymal stromal cells derived from healthy animals (MSCc) in diabetes animal models. However, the ability of MSC derived from diabetic rats to improve functional cardiac parameters is still unknown. Objectives: To investigate whether bone-marrow-derived MSC from diabetic rats (MSCd) would contribute to recover metabolic and cardiac electrical properties in other diabetic rats. Methods: Diabetes was induced in Wistar rats with streptozotocin. MSCs were characterized by flow cytometry, morphological analysis, and immunohistochemistry. Cardiac electrical function was analyzed using recordings of ventricular action potential. Differences between variables were considered significant when p < 0.05. Results: In vitro properties of MSCc and MSCd were evaluated. Both cell types presented similar morphology, growth kinetics, and mesenchymal profile, and could differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. However, in an assay for fibroblast colony-forming units (CFU-F), MSCd formed more colonies than MSCc when cultured in expansion medium with or without hydrocortisone (1 µM). In order to compare the therapeutic potential of the cells, the animals were divided into four experimental groups: nondiabetic (CTRL), diabetic (DM), diabetic treated with MSCc (DM + MSCc), and diabetic treated with MSCd (DM + MSCd). The treated groups received a single injection of MSC 4 weeks after the development of diabetes. MSCc and MSCd controlled hyperglycemia and body weight loss and improved cardiac electrical remodeling in diabetic rats. Conclusions: MSCd and MSCc have similar in vitro properties and therapeutic potential in a rat model of diabetes induced with streptozotocin.
Resumo Fundamentos: O diabetes mellitus é uma doença crônica grave que leva a complicações sistêmicas, como a disfunção cardiovascular. Estudos anteriores de terapia celular obtiveram resultados promissores com utilização de células estromais mesenquimais (CEM) derivadas de medula óssea de animais saudáveis (CEMc) em modelos de animais diabéticos. No entanto, a capacidade das CEM derivadas de ratos diabéticos em melhorar parâmetros cardíacos funcionais é ainda desconhecida. Objetivos: Investigar se CEM derivadas de medula óssea de ratos diabéticos (CEMd) poderiam contribuir para a recuperação metabólica e de propriedades elétricas cardíacas em outros ratos também com diabetes. Métodos: O diabetes foi induzido em ratos Wistar com estreptozotocina. As CEM foram caracterizadas por citometria de fluxo, análise morfológica e imunohistoquímica. A função elétrica cardíaca foi analisada através de registro do potencial de ação ventricular. As diferenças entre as variáveis foram consideradas significativas quando p < 0,05. Resultados: As propriedades in vitro das CEMc e CEMd foram avaliadas. Ambos os tipos celulares apresentaram morfologia, cinética de crescimento e perfil mesenquimal semelhante, e puderam ser diferenciadas em linhagens adipogênica e osteogênica. No entanto, em ensaios para unidades formadoras de colônias de fibroblastos (UFC-F), as CEMd formaram mais colônias em comparação às CEMc quando cultivadas em meio com ou sem hidrocortisona (1 µM). Para comparar o potencial terapêutico das células, os animais foram divididos em quatro grupos experimentais: não diabéticos (CTRL), diabéticos (DM), diabéticos tratados com CEMc (DM + CEMc) e diabéticos tratados com CEMd (DM + CEMd). Os grupos tratados receberam uma única injeção de CEM 4 semanas após o estabelecimento do diabetes. Ambas CEMc e CEMd controlaram a hiperglicemia e a perda de peso corporal e melhoraram o remodelamento elétrico cardíaco em ratos com diabetes. Conclusão: As CEMd e CEMc possuem propriedades in vitro e potencial terapêutico semelhante em um modelo de rato com diabetes induzido por estreptozotocina. (Arq Bras Cardiol. 2017; 109(6):579-589)
Subject(s)
Animals , Male , Rats , Mesenchymal Stem Cell Transplantation , Diabetes Mellitus, Experimental/chemically induced , Mesenchymal Stem Cells/cytology , Cell- and Tissue-Based Therapy , Heart Diseases/etiology , Heart Diseases/therapy , Blood Glucose/metabolism , Cell Differentiation , Cells, Cultured , Rats, Wistar , Mesenchymal Stem Cells/metabolismABSTRACT
Abstract Introduction The rationale of mesenchymal stem cells (MSCs) as a novel therapeutic approach in certain neurodegenerative diseases is based on their ability to promote neurogenesis. Hippocampal atrophy has been related to bipolar disorder (BD) in preclinical, imaging and postmortem studies. Therefore, the development of new strategies to stimulate the neurogenesis process in BD is crucial. Objectives To investigate the behavioral and neurochemical changes induced by transplantation of MSCs in a model of mania-like behavior induced by lisdexamfetamine dimesylate (LDX). Methods Wistar rats (n=65) received one oral daily dose of LDX (10 mg/kg) or saline for 14 days. On the 8th day of treatment, the animals additionally received intrahippocampal saline or MSC (1 µL containing 25,000 cells) or lithium (47.5 mg/kg) as an internal experimental control. Two hours after the last administration, behavioral and neurochemical analyses were performed. Results LDX-treated rats had increased locomotor activity compared to saline-saline rats (p=0.004), and lithium reversed LDX-related hyperactive behavior (p<0.001). In contrast, the administration of MSCs did not change hyperlocomotion, indicating no effects of this treatment on LDX-treated rats (p=0.979). We did not find differences between groups in BDNF levels (p>0.05) in the hippocampus of rats. Conclusion Even though these results suggest that a single intrahippocampal injection of MSCs was not helpful to treat hyperactivity induced by LDX and neither influenced BDNF secretion, we cannot rule out the possible therapeutic effects of MSCs. Further research is required to determine direct effects of LDX on brain structures as well as in other pathophysiological targets related to BD.
Resumo Introdução Células-tronco mesenquimais (CTMs) têm emergido como um promissor tratamento em diversas doenças neurodegenerativas devido a sua plasticidade e capacidade de regenerar tecidos. Estudos pré-clínicos, clínicos e de neuroimagem têm demonstrado a presença de atrofia hipocampal no transtorno bipolar (TB). Portanto, o desenvolvimento de tratamentos capazes de regenerar tecido lesado e estimular a neurogênese poderia ser útil. Objetivos Investigar mudanças comportamentais e neuroquímicas induzidas pelo transplante de CTMs no hipocampo de ratos em um modelo animal de mania induzido por dimesilato de lisdexanfetamina (LDX). Métodos Ratos Wistar (n=65) receberam LDX (10 mg/kg) ou solução salina por via oral durante 14 dias. No oitavo dia, os animais foram transplantados com injeção de CTMs ou solução salina (1 µL contendo 25.000 células) ou lítio (47,5 mg/kg) como controle interno do experimento. Duas horas após a última dose, foram realizadas análises comportamentais e neuroquímicas. Resultados Animais que receberam LDX tiveram um aumento da atividade locomotora comparados ao grupo que recebeu solução salina (p=0,004); já o lítio reverteu a hiperatividade locomotora desses animais (p<0,001). Os animais que receberam CTMs não apresentaram alterações no comportamento, indicando ausência de efeitos sobre hiperatividade locomotora. Os níveis de BDNF hipocampais não diferiram entre os grupos (p>0.05). Conclusão Não foi possível demonstrar efeitos neuroprotetores das CTMs, administradas em dose única, em um modelo animal de mania induzido por LDX. No entanto, não se pode descartar os possíveis efeitos terapêuticos das CTMs. Mais estudos são necessários para determinar os efeitos das CTMs em estruturas cerebrais e outros alvos fisiopatológicos relacionados ao TB.
Subject(s)
Animals , Male , Bipolar Disorder/therapy , Mesenchymal Stem Cell Transplantation , Bipolar Disorder/metabolism , Cells, Cultured , Adipose Tissue/cytology , Rats, Wistar , Lithium Compounds/pharmacology , Antimanic Agents/pharmacology , Brain-Derived Neurotrophic Factor/metabolism , Disease Models, Animal , Lisdexamfetamine Dimesylate , Proof of Concept Study , Hippocampus/surgery , Hippocampus/metabolism , Mice, Inbred C57BL , Motor Activity/drug effects , Motor Activity/physiologyABSTRACT
O crescente interesse do uso de células-tronco (CTs) na medicina regenerativa, estão baseadas na sua capacidade de autorrenovação, reparação tecidual e imunomodulação. A terapia utilizando células-tronco é uma ciência em formação considerada uma alternativa terapêutica promissora no tratamento de diversas patologias degenerativas, hereditárias e inflamatórias. A busca por fontes alternativas de CTs que possuam características como fácil obtenção e isolamento, tem levado ao estudo dos mais variados tecidos, onde se inclui os anexos embrionários como a membrana amniótica. Porém, para sua efetiva aplicação terapêutica são necessários estudos de suas características "in vitro", além de testes pré-clínicos e clínicos. Com isso, o objetivo deste trabalho é realizar uma revisão bibliográfica sobre a caracterização e aplicação clínica das células-tronco da membrana amniótica em diversas espécies de animais domésticos.(AU)
The increasing interest for the use of stem cells in regenerative medicine, is based on their self-renewal capacity, tissue repair and immunomodulation. The therapy with stem cells is a science in formation considered a promising therapeutic alternative for the treatment of various degenerative, hereditary and inflammatory disorders. The search for alternative sources of stem cells of easy obtention and isolation has led to the study of various tissues, includng embryonic attachments such as the amniotic membrane. However for effective therapeutic application are needed studies of the characteristics in vitro and preclinical and clinical trials. Thus, the aim of this study was a literature review regarding the characterization and clinical application of stem cells from the amniotic membrane in several domestic animal species.(AU)
Subject(s)
Animals , Amnion , Embryonic Stem Cells , Cats , Cattle , Cell- and Tissue-Based Therapy/methods , Dogs , Horses , Pluripotent Stem Cells , Sheep , SwineABSTRACT
This study evaluated in vitro differentiation of mesenchymal stromal cells isolated from bone marrow, in tenocytes after treatment with bovine tendon extract. METHODS: Bovine tendons were used for preparation of the extract and were stored at -80 °C. Mesenchymal stromal cells from the bone marrow of three donors were used for cytotoxicity tests by means of MTT and cell differentiation by means of qPCR. RESULTS: The data showed that mesenchymal stromal cells from bone marrow treated for up to 21 days in the presence of bovine tendon extract diluted at diminishing concentrations (1:10, 1:50 and 1:250) promoted activation of biglycan, collagen type I and fibromodulin expression. CONCLUSION: Our results show that bovine tendon extract is capable of promoting differentiation of bone marrow stromal cells in tenocytes.
O estudo avalia a diferenciação in vitro das células mesenquimais isoladas do estroma da medula óssea em tenócitos após tratamento com extrato de tendão bovino. MÉTODOS: Tendões bovinos foram usados para confecção do extrato e estocados a -80 °C. Células mesenquimais do estroma da medula óssea (BMSCs) de três doadores foram usadas para os testes de citotoxicidade por MTT e diferenciação celular por qPCR. RESULTADOS: Os dados mostram que células mesenquimais do estroma da medula óssea tratadas por até 21 dias em presença do extrato de tendão bovino diluído em concentrações crescentes (1:10, 1:50 e 1:250) promovem a ativação da expressão de biglican, colágeno tipo I e fibromodulina. CONCLUSÃO: Nossos resultados mostram que o extrato de tendão bovino é capaz de promover a diferenciação das BMSCs em tenócitos.
Subject(s)
Animals , Cattle , Bone Marrow , Mesenchymal Stem Cells , TendonsABSTRACT
As células-tronco mesenquimais (CTM) constituem uma ferramenta promissora para o campo de terapia celular. Além de seu potencial de diferenciação em diferentes tipos celulares, as CTM apresentam a habilidade de secretar moléculas bioativas e, assim, exercer múltiplos efeitos biológicos, tais como indução da regeneração de tecidos lesionados, redução de fibrose e modulação do sistema imune. A superexpressão dos fatores de crescimento G-CSF e IGF-1, conhecidos por seus efeitos sobre os processos de imunomodulação, sobrevivência celular e reparo tecidual, pode ampliar as ações terapêuticas das CTM. O objetivo deste trabalho consiste em gerar e caracterizar linhagens de CTM de camundongo superexpressando hGCSF ou hIGF-1. Um sistema lentiviral de segunda geração foi utilizado para modificação de CTM para expressão ectópica dos genes de interesse. As sequências codificantes de hG-CSF e hIGF-1 foram amplificadas por PCR e subclonadas em um vetor lentiviral de transferência, contendo um promotor constitutivo. As partículas lentivirais foram produzidas a partir da cotransfecção de células da linhagem HEK293FT...
Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising tool for the cell therapy field. In addition to their potential for differentiation into different cell types, MSCs have the ability to secrete bioactive molecules and thus exert multiple biological effects such as induction of the injured tissue regeneration, fibrosis reduction and modulation of the immune system. The overexpression of the growth factors G-CSF and IGF-1, known for their effects on immune modulation processes, cell survival and tissue repair, can result in a magnification of MSCs' therapeutic actions. The objective of this work is to generate and characterize mouse MSCs lines overexpressing hG-CSF or hIGF-1. A second generation lentiviral system was used to modify MSCs derived from mice for the ectopic expression of the genes of interest. The coding sequences of hG-CSF and hIGF-1 were amplified by PCR and subcloned into a lentiviral transfer vector containing a constitutive promoter. The lentiviral particles were produced from the co-transfection of HEK293FT...
Subject(s)
Animals , Stem Cells/classification , Stem Cells/immunology , Stem Cells/pathology , Insulin , Insulin/analysis , Insulin/genetics , Insulin/blood , Insulin/urineABSTRACT
Mesenchymal stem cells (MSC) are increasingly being proposed as a therapeutic option for treatment of a variety of different diseases in human and veterinary medicine. Stem cells have been isolated from feline bone marrow, however, very few data exist about the morphology of these cells and no data were found about the morphometry of feline bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs). The objectives of this study were the isolation, growth evaluation, differentiation potential and characterization of feline BM-MSCs by their morphological and morphometric characteristics. in vitro differentiation assays were conducted to confirm the multipotency of feline MSC, as assessed by their ability to differentiate into three cell lineages (osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes). To evaluate morphological and morphometric characteristics the cells are maintained in culture. Cells were observed with light microscope, with association of dyes, and they were measured at 24, 48, 72 and 120h of culture (P1 and P3). The non-parametric ANOVA test for independent samples was performed and the means were compared by Tukey's test. On average, the number of mononuclear cells obtained was 12.29 (±6.05x106) cells/mL of bone marrow. Morphologically, BM-MSCs were long and fusiforms, and squamous with abundant cytoplasm. In the morphometric study of the cells, it was observed a significant increase in average length of cells during the first passage. The cell lengths were 106.97±38.16µm and 177.91±71.61µm, respectively, at first and third passages (24 h). The cell widths were 30.79±16.75 µm and 40.18±20.46µm, respectively, at first and third passages (24 h).The nucleus length of the feline BM-MSCs at P1 increased from 16.28µm (24h) to 21.29µm (120h). However, at P3, the nucleus length was 26.35µm (24h) and 25.22µm (120h). This information could be important for future application and use of feline BM-MSCs.(AU)
As células tronco mesenquimais são utilizadas na terapia de várias doenças na medicina humana e veterinária. As células tronco foram isoladas da medula óssea de gato, entretanto, existem poucos dados referentes a morfologia e não existem informações sobre a morfometria das células tronco isoladas da medula óssea. Os objetivos do presente estudo foram o isolamento, avaliação do crescimento, potencial de diferenciação e caracterização morfológica e morfométrica das células mesenquimais de gato isoladas de medula óssea. A diferenciação in vitro foi realizada para confirmar a multipotencialidade das células mesenquimais de gato (diferenciação em osteoblastos, condrócitos, adipócitos). As células mesenquimais foram mantidas em cultivo para avaliações morfológica e morfométrica. As células foram coradas e observadas em microscopia ótica. As mensurações foram realizadas com 24, 48, 72 e 120h de cultura (primeira e terceira passagens). O teste não paramétrico ANOVA foi utilizado e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey. O número médio de células mononucleares obtido foi de 12,29 (±6,05x106) células/mL de medula óssea. As células mesenquimais são longas e fusiformes, e escamosas com citoplasma abundante. No estudo morfométrico, observou-se aumento no comprimento médio das células durante a primeira passagem. As medidas de comprimento das células foram: 106,97±38,16µm e 177,91±71,61µm, respectivamente, na primeira e terceira passagens (24 horas). As medidas de largura das células foram: 30,79±16,75 µm e 40,18±20,46 µm, respectivamente, na primeira e terceira passagens (24 horas). O comprimento do núcleo na primeira passagem aumentou de 16,28µm (24h) para 21,29µm (120h) e na terceira passagem foi de 26,35µm (24h) para 25,22µm (120h). As informações são importantes para futuras aplicações e uso da célula mesenquimal de gato.(AU)
Subject(s)
Animals , Cats , Bone Marrow/anatomy & histology , Mesenchymal Stem Cells/cytologyABSTRACT
A hipertensão arterial representa um fator de risco sistêmico para várias doenças incluindo redução da massa óssea por aumentar a reabsorção e diminuir a formação óssea. Considerando que a formação óssea é resultante da atividade de osteoblastos, o objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de células osteoblásticas diferenciadas de CTMs (células-tronco mesenquimais) de SHR. A partir de medulas ósseas de fêmures de SHR, CTMs foram obtidas por adesão ao plástico de cultura de células e diferenciadas em osteoblastos por cultura em meio osteogênico até que atingissem a subconfluência. Em seguida, as células foram subcultivadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de 24 poços. Células obtidas de Wistar foram utilizadas como controle. Para a avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada e expressão gênica dos marcadores osteoblástico: 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX), 3) Fosfatase alcalina (ALP), 4) Proteína óssea morfogenética 2 (BMP2); 5) Sialoproteína óssea (BSP), 6) Osteocalcina (OC), 7) Osteopontina (OPN), 8) e Colágeno (COL), além dos receptores β1 e β2 adrenérgicos. Os dados foram comparados pelo teste ANOVA seguido do teste de Tukey, e o nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05). Células osteoblásticas de SHR apresentaram alterações no fenótipo osteoblástico, exibindo, em todos os períodos avaliados, menor proliferação celular, atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. A expressão gênica de todos os marcadores ósseos também foi menor em SHR quando comparado com Wistar na maioria dos períodos avaliados. A expressão gênica do receptor β2 adrenérgico foi maior em SHR em todos os períodos avaliados e não foi detectada a expressão do receptor β1 tanto em SHR como em Wistar. Com base nesses resultados, podemos concluir que os osteoblastos diferenciados das CTMs de...
Hypertension is a systemic risk factor for several diseases including reduction of bone mass by increasing bone resorption and reducing bone formation. Considering that bone formation results from osteoblast activity, the aim of this study was to assess the phenotypic and genotypic characteristics of osteoblastic cells differentiated from MSCs of SHR. Bone marrow was harvested from SHR femurs and MSCs were selected by adherence to plastic cell culture and differentiated into osteoblasts by culturing in osteogenic medium until subconfluence. Then, the cells were subcultured at a density of 2x104 cells / well in 24 well plates. Cells from Wistar rats were used as control. Cells responses were evaluated by assaying proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation and the gene expression of the osteoblastic markers: runt-related 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX) 3) Alkaline phosphatase (ALP), 4) Bone morphogenetic protein 2 (BMP2); 5) Bone sialoprotein (BSP), 6) Osteocalcin (OC), 7) Osteopontin (OPN), 8) and Collagen type 1 alpha (COL), in addition to the gene expression of β1 and β2 adrenergic receptors. Data were compared by ANOVA followed by Tukey test and the level of significance was 5% (p ≤ 0.05). SHR derived osteoblasts showed changes in osteoblastic phenotype, exhibiting in all periods reduced cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation. The gene expression of all bone markers was also lower in SHR compared with Wistar in many periods. The gene expression of the β2 adrenergic receptor was greater in SHR in all periods and it was not detected the expression of β1receptor either in SHR or Wistar. Based on these results, we conclude that osteoblasts differentiated from SHR MSCs exhibit reduced or delayed in the differentiation process. We also suggest that overexpression of β2 adrenergic receptors may have acted in prejudice of osteoblastic differentiation
Subject(s)
Animals , Rats , Cell Culture Techniques , Gene Expression , Mesenchymal Stem Cells , Osteoblasts , Receptors, Adrenergic , Rats, Inbred SHR , Rats, WistarABSTRACT
Células tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do estroma da medula óssea possuem potencial para se diferenciar in vivo e in vitro, em vários tipos celulares, incluindo osteoblastos e adipócitos. Durante o envelhecimento, há o maior número de células que se diferenciam espontaneamente em adipócitos, comprometendo a qualidade óssea, bem como perda da massa óssea decorrente do estilo de vida sedentário. Dentre fatores capazes de modular a diferenciação de CTMs em prol a formação óssea, sinais mecânicos estão sendo estudados como alternativa para o tratamento da osteoporose. Neste estudo, analisamos como o treinamento de força (TF) influencia a remodelação óssea durante o envelhecimento. Para isso, analisamos o potencial osteogênico de diferenciação de CTMs isoladas da medula óssea de ratas adultas (09 meses) e idosas (21 meses) que realizaram ou não o exercício físico com sobrecarga. Os resultados mostraram que o TF aumentou a expressão da proteína óssea morfogênica 2 (BMP2), regulando a diferenciação dos osteoblastos e formação óssea por promover up-regulation do fator de transcrição relacionado com o Runt 2 (Runx2) e down-regulation do fator de transcrição de adipócitos, receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ (Pparγ) em CTMs diferenciadas de doadoras idosas. Além disso, os valores de densidade mineral óssea areal e os parâmetros biomecânicos na tíbia das ratas idosas foram otimizados após a realização do TF. Estes resultados sugerem que o aumento dos fatores de transcrição e proteínas de matriz, bem como o decréscimo de Pparγ, desencadeado pelo TF, contribui para a melhoria da qualidade do osso de ratas idosas treinadas...
In vivo and in vitro studies indicate that a subpopulation of bone marrow stromal cells derived mesenchymal stem cells (MSCs) has potential to differentiate into multiple cell types, including osteoblasts and adipocytes. During the aging, greater number of cells is able to differentiate spontaneously into adipocytes, committing bone quality, well as loss of bone mass due to the sedentary lifestyle. Among the factors capable of modulating differentiation of MSCs to promote bone formation mechanical signals are being studied as an alternative for the treatment of osteoporosis. In this study, we analyzed how the strength training (ST) participates in the bone remodeling during the aging. For this purpose, we analyzed the osteogenic potential of differentiation of MSCs isolated from the bone marrow of adult (09 months) and elderly (21 months) female rats that performed or not physical activity with overcharge. The results showed that the ST increased the bone morphogenic protein 2 (BMP2), regulated the osteoblast differentiation and bone formation for up-regulation of the osteogenic master transcription factor, Runt-related transcription factor 2 (Runx2) and the down-regulation of the adipocytes master transcription factor, peroxisome proliferator-activated receptor γ (Pparγ) in differentiated MSCs of the elderly donors. In addition, the values of areal bone mineral density and biomechanical parameters in the tibia of elderly rats were optimized after the realization of ST. These results suggest that increase of transcription factors and matrix proteins as well as the decrease of Pparγ, triggered by ST, contributes to better bone quality of trained elderly...
Subject(s)
Animals , Rats , Aging , Mesenchymal Stem Cells , Osteoblasts , Osteoporosis , Resistance TrainingABSTRACT
A hipertensão arterial representa um fator de risco sistêmico para várias doenças incluindo redução da massa óssea por aumentar a reabsorção e diminuir a formação óssea. Considerando que a formação óssea é resultante da atividade de osteoblastos, o objetivo deste estudo foi avaliar as características fenotípicas e genotípicas de células osteoblásticas diferenciadas de CTMs (células-tronco mesenquimais) de SHR. A partir de medulas ósseas de fêmures de SHR, CTMs foram obtidas por adesão ao plástico de cultura de células e diferenciadas em osteoblastos por cultura em meio osteogênico até que atingissem a subconfluência. Em seguida, as células foram subcultivadas na densidade de 2x104 células/poço em placas de 24 poços. Células obtidas de Wistar foram utilizadas como controle. Para a avaliação das respostas celulares foram realizados ensaios de proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz mineralizada e expressão gênica dos marcadores osteoblástico: 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX), 3) Fosfatase alcalina (ALP), 4) Proteína óssea morfogenética 2 (BMP2); 5) Sialoproteína óssea (BSP), 6) Osteocalcina (OC), 7) Osteopontina (OPN), 8) e Colágeno (COL), além dos receptores β1 e β2 adrenérgicos. Os dados foram comparados pelo teste ANOVA seguido do teste de Tukey, e o nível de significância adotado foi de 5% (p≤0,05). Células osteoblásticas de SHR apresentaram alterações no fenótipo osteoblástico, exibindo, em todos os períodos avaliados, menor proliferação celular, atividade de ALP e formação de matriz mineralizada. A expressão gênica de todos os marcadores ósseos também foi menor em SHR quando comparado com Wistar na maioria dos períodos avaliados. A expressão gênica do receptor β2 adrenérgico foi maior em SHR em todos os períodos avaliados e não foi detectada a expressão do receptor β1 tanto em SHR como em Wistar. Com base nesses resultados, podemos concluir que os osteoblastos diferenciados das CTMs...
Hypertension is a systemic risk factor for several diseases including reduction of bone mass by increasing bone resorption and reducing bone formation. Considering that bone formation results from osteoblast activity, the aim of this study was to assess the phenotypic and genotypic characteristics of osteoblastic cells differentiated from MSCs of SHR. Bone marrow was harvested from SHR femurs and MSCs were selected by adherence to plastic cell culture and differentiated into osteoblasts by culturing in osteogenic medium until subconfluence. Then, the cells were subcultured at a density of 2x104 cells / well in 24 well plates. Cells from Wistar rats were used as control. Cells responses were evaluated by assaying proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized matrix formation and the gene expression of the osteoblastic markers: runt-related 1) runt-related transcription fator 2 (RUNX2), 2) Osterix (OSX) 3) Alkaline phosphatase (ALP), 4) Bone morphogenetic protein 2 (BMP2); 5) Bone sialoprotein (BSP), 6) Osteocalcin (OC), 7) Osteopontin (OPN), 8) and Collagen type 1 alpha (COL), in addition to the gene expression of β1 and β2 adrenergic receptors. Data were compared by ANOVA followed by Tukey test and the level of significance was 5% (p ≤ 0.05). SHR derived osteoblasts showed changes in osteoblastic phenotype, exhibiting in all periods reduced cell proliferation, ALP activity and mineralized matrix formation. The gene expression of all bone markers was also lower in SHR compared with Wistar in many periods. The gene expression of the β2 adrenergic receptor was greater in SHR in all periods and it was not detected the expression of β1receptor either in SHR or Wistar. Based on these results, we conclude that osteoblasts differentiated from SHR MSCs exhibit reduced or delayed in the differentiation process. We also suggest that overexpression of β2 adrenergic receptors may have acted in prejudice of osteoblastic differentiation...
Subject(s)
Animals , Rats , Cell Culture Techniques , Gene Expression , Mesenchymal Stem Cells , Osteoblasts , Receptors, Adrenergic , Rats, Inbred SHR , Rats, WistarABSTRACT
PURPOSE: To investigate neurotrophins expression and neurotrophic effect change in mesenchymal stem cells (MSCs) under different types of stimulation. METHODS: Rats were exposed in 10,000 lux white light to develop light-induced retinal injury. Supernatants of homogenized retina (SHR), either from normal or light-injured retina, were used to stimulate MSCs. Quantitative real time for polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were conducted for analysis the expression change in basic fibroblast growth factor (bFGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and ciliary neurotrophic factor (CNTF) in MSCs after stimulation. Conditioned medium from SHR-stimulated MSCs and control MSCs were collected for evaluation their effect on retinal explants. RESULTS: Supernatants of homogenized retina from light-injured rats significantly promoted neurotrophins secretion from MSCs (p<0.01). Conditioned medium from mesenchymal stem cells stimulated by light-injured SHR significantly reduced DNA fragmentation (p<0.01), up-regulated bcl-2 (p<0.01) and down-regulated bax (p<0.01) in retinal explants, displaying enhanced protective effect. CONCLUSIONS: Light-induced retinal injury is able to enhance neurotrophins secretion from mesenchymal stem cells and promote the neurotrophic effect of mesenchymal stem cells.
OBJETIVO: Investigar a expressão de neurotrofinas e mudança no efeito neurotrófico de células-tronco mesenquimais (MSCs) sob diferentes tipos de estimulação. MÉTODOS: Os ratos foram expostos em 10.000 lux de luz branca para desenvolver a lesão da retina induzida por luz. Os sobrenadantes de homogeneizado de retina (SHR) quer a partir de retina normal ou da lesada por luz, foram usados para estimular as células-tronco mesenquimais. O RT-PCR quantitativa e ELISA foram realizados para análise da alteração de expressão do fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e do fator neurotrófico ciliar (CNTF) em MSCs após a estimulação. O meio condicionado de células-tronco mesenquimais estimuladas por SHR e controles foram coletadas para avaliação de seu efeito sobre os explantes de retina. RESULTADOS: SHR de retinas de rato lesadas por luz promoveram aumento significativo de secreção de neurotrofinas em MSCs (p<0,01). O meio condicionado de SHR lesado por luz reduziu significativamente a fragmentação do DNA de MSCs (p<0,01), elevação de Bcl-2 (p<0,01) e redução de bax (p<0,01) em explantes de retina, mostrando um aumento do efeito protetor. CONCLUSÕES: A lesão da retina induzidos pela luz é capaz de aumentar a secreção de neurotrofinas e promover o efeito neurotrófico de células-tronco mesenquimais.
Subject(s)
Animals , Rats , Light , Mesenchymal Stem Cells , Nerve Growth Factors , Retina/radiation effects , Brain-Derived Neurotrophic Factor , Cells, Cultured , Ciliary Neurotrophic Factor , Disease Models, Animal , Fibroblast Growth Factors/metabolism , Mesenchymal Stem Cells/cytology , Random Allocation , Rats, Sprague-Dawley , Real-Time Polymerase Chain Reaction , Retina/cytology , Retina/injuriesABSTRACT
Durante el desarrollo embriológico las extremidades surgen de la condensaciónde células mesenquimales y su diferenciación a condrocitos en un proceso llamado condrogénesis. Estos condrocitos sintetizanglicosaminoglicanos, jugando un papel importante durante este proceso. Existe un sistema de condrogénesis in vitro utilizandocélulas mesenquimales generalmente evaluado mediante histoquímica. Objetivo. Establecer un sistema de puntaje semi-automáticopara ensayos histoquímicos e inmunohistoquímicos. Materiales y métodos. Para condrogénesis las células fueron cultivadas conmedio inductor en agregados por tres semanas. Los glicosaminoglicanos totales fueron determinados mediante azul de dimetileno.Para el análisis histológico los agregados fueron teñidos con azul de alcian e inmunohistoquímica para detección de agrecán. Lapuntuación semi-automática fue obtenida utilizando el programa ImageJ. Resultados. Las células mesenquimales cultivadas enmedio de diferenciación condrogénica tuvieron una concentración de proteína comparable durante las tres semanas de cultivo,sugiriendo una celularidad similar. La concentración de glicosaminoglicanos fue superior para los agregados cultivados en mediocondrogénico. La misma tendencia fue observada para la tinción de azul de alcian mediante puntajes del observador ciego y análisiscon ImageJ. Finalmente, los resultados de inmunohistoquímica de puntajes asignados por el observador y los del análisis porImageJ revelaron una tendencia decreciente con el tiempo para agregados en medio condrogénico. Conclusión. Desarrollamos un sistema funcional para generación de puntaje semi-automático para diferenciación condrogénica. Corroboramos estos resultadosmediante análisis bioquímico con resultados comparables. En nuestro saber este es el primer reporte en evaluar esta metodología,la cual puede ser útil para otras aplicaciones en el campo biológico o médico...
During embryological limb formation mesenchymal cells condense and differentiate into chondrocytes, in a process known aschondrogenesis. These chondrocytes synthesize glycosaminoglycans (GAGs), thus playing an important role in this process.A simplified system in vitro chondrogenesis, using adult mesenchymal stromal cells (MSCs) has been demonstrated. Thisdifferentiation potential is usually assessed by histological staining. Objective. Establishment of a semi-automatic grading systemfor histochemistry stains and immunohistochemistry assays. Materials and methods. For chondrogenesis cells were culturedfor three weeks in aggregates with inducing media. Total GAGs were measured using dimethylmethylene blue (DMB) method.For histological analyses aggregates were stained with Alcian blue for total GAGs detection and immunohistochemistry (IHC)for aggrecan was performed. Semi-automatic grading for all slides was obtained after ImageJ analysis. Results. MSCs culturedas aggregates in chondrogenic differentiation media had similar protein concentrations for all time points, suggesting cellularityremained homogenous during culture. Total GAGs was higher for aggregates cultured in chondrogenic compared to complete media.The same trend was observed for Alcian blue stain grades by blinded observer and analysis using ImageJ software. Aggrecans IHCanalysis had a decreasing tendency with time for aggregates in chondrogenic media for blinded observer and ImageJ evaluation.Conclusion. We developed a functional system for semi-automatic slide grading. We corroborated these results by biochemicalanalysis with comparable results. To our knowledge, for in vitro chondrogenesis, this is the first report to evaluate stains usingthis methodology. This procedure might be useful for other applications in the field of Biology and Medical Sciences...
Durante o desenvolvimento embrionário os membros emergem a partir da condensação decélulas mesenquimais e sua diferenciação em condrócitos em um processo chamado condrogênese. Estes condrócitos sintetizamglicosaminoglicanos, desempenhando um papel importante neste processo. Existe um sistema de condrogénese in vitro utilizandocélulas mesenquimatosas, geralmente avaliado por histoquímica. Objetivo. Estabelecer um sistema de pontuação semi-automáticopara ensaios histoquímicos e imuno-histoquímicos. Materiais e métodos. Na condrogênese as células foram cultivadas commeio indutor em agregados, durante três semanas. Os glicosaminoglicanos totais foram determinados pelo azul de dimetileno.Para a análise histológica os agregados foram corados com Azul Alciano e imuno-histoquímica para detecção de agrecan. Apontuação semi-automática foi obtida utilizando o programa ImageJ. Resultados. As células mesenquimais cultivadas em meiode diferenciação condrogênica tiveram uma concentração de proteína comparável durante as três semanas de cultura, o que sugereuma celularidade similar. A concentração de glicosaminoglicanos foi maior para os agregados cultivados em meio condrogênico.A mesma tendência foi observada para a coloração com Azul Alciano segundo as pontuações do observador cego e a análisecom ImageJ. Finalmente, os resultados de imuno-histoquímica de pontuações dados pelo observador e aqueles dados pela análiseImageJ revelaram uma tendência decrescente ao longo do tempo para os agregados em meio condrogênico. Conclusão. Nósrealizamos um sistema funcional para gerar pontuação semi-automática para diferenciação condrogênica. Nós corroboramos essesresultados por análise bioquímica com resultados comparáveis. Segundo nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a avaliaresta metodologia, que pode ser útil para outras aplicações no campo biológico ou médico...
Subject(s)
Chondrogenesis , Mesenchymal Stem Cells/classification , EmbryologyABSTRACT
As fraturas e perdas ósseas representam altos riscos para o Sistema público de Saúde (SUS), além de afetar a qualidade de vida do paciente, portanto é necessário o entendimento das bases moleculares que envolvem os mecanismos de reparo ósseo. Citocinas secretadas por células do sistema imune presentes no local da inflamação, como as IL-6, IL-10 e TNFα atuam como fatores quimiotáticos para células mesenquimais, que proliferam e se diferenciam em osteoblastos pela ação autócrina e parácrina de Proteínas Morfogenéticas Ósseas (BMPs), principalmente a BMP2. Embora seja conhecido que a ação de BMP2 ocorra através de sua ligação nos receptores ActRI/BMPR, que ativam proteínas SMADS 1/5/8 efetoras, pouco se sabe sobre os mecanismos intracelulares que participam do processo de diferenciação osteoblástico. Neste estudo propôs-se analisar as diferenças no conteúdo de proteínas totais e de proteínas fosforiladas em células mesenquimais de pele induzidas à osteogênese pelo tratamento com BMP2 por diferentes períodos de tempo, utilizando-se de Isótopos Estáveis de Dimetila acoplado ao LC/MS. A partir de 150µg de material inicial, foi possível identificar 2.264 proteínas, as quais foram quantificadas nos diferentes pontos de indução, sendo que 235 são fosforiladas. Análise de motivos de quinases mostrou que diversos substratos possuem sítios fosforilados correspondentes àqueles dos motivos de fosforilação das quinases Casein Kinase, p38, CDK e JNK. A análise da ontologia gênica mostrou um aumento de processos biológicos relacionados com sinalização e diferenciação após a primeira hora de indução com rhBMP2. Além disso, proteínas envolvidas com o rearranjo do citoesqueleto e com vias de sinalização Wnt e Ras foram encontradas como tendo fosforilação diferencial durante todos os períodos estudados. Os dados revelaram novos substratos intracelulares que são fosforilados nos primeiros momentos do comprometimento com a diferenciação osteoblástica mediada pelo tratamento com rhBMP2 em células mesenquimais derivadas da pele. Além disso, clones celulares que superexpressam as proteínas recombinantes humanas BMP2 e BMP4 foram gerados, e sua atividade verificada in vitro. Paralelamente, a rhBMP7, obtida anteriormente, foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando-se uma coluna de Heparina-Sepharose, que foi posteriormente utilizada para ensaios in vitro e in vivo, nos quais se mostrou capaz de gerar osteoblastos e tecido ósseo, respectivamente, o que abre novas possibilidades para o uso destas proteínas como biofármacos no Brasil
Bone fractures and loss represent significant costs for the public health system and often affect the patients quality of life, therefore, understanding the molecular basis for bone regeneration is essential. Cytokines, such as IL-6, IL-10 and TNFα, secreted by inflammatory cells at the lesion site, at the very beginning of the repair process, act as chemotactic factors for mesenchymal stem cells, which proliferate and differentiate into osteoblasts through the autocrine and paracrine action of bone morphogenetic proteins (BMPs), mainly BMP-2. Although it is known that BMP-2 binds to ActRI/BMPR and activates the SMAD 1/5/8 downstream effectors, little is known about the intracellular mechanisms participating in osteoblastic differentiation. We assessed differences in the phosphorylation status of different cellular proteins upon BMP-2 osteogenic induction of isolated human skin mesenchymal stem cells using Triplex Stable Isotope Dimethyl Labeling coupled with LC/MS. From 150 µg of starting material, 2,264 proteins containing two or more peptides were identified and quantified at five different time points, 235 of which are differentially phosphorylated. Kinase motif analysis showed that several substrates display phosphorylation sites for Casein Kinase, p38, CDK and JNK. Gene ontology analysis showed an increase in biological processes related with signaling and differentiation at early time points after BMP2 induction. Moreover, proteins involved in cytoskeleton rearrangement, Wnt and Ras pathways were found to be differentially phosphorylated during all timepoints studied. Taken together, these data, allow new insights on the intracellular substrates which are phosphorylated early on during commitment to BMP2-driven osteoblastic differentiation of skin-derived mesenchymal stem cells. Cell clones overexpressing the human BMP 2 and 4 recombinant proteins were also generated, and their biological activity was confirmed in vitro. In parallel, chromatography-affinity purified rhBMP7, obtained using heparin-Sepharose columns, was used for in vivo and in vitro assays to evaluate the ability of this purified protein to generate osteoblasts and bone tissue, respectively, opening new avenues for the use of these proteins as biopharmaceuticals in Brazil
Subject(s)
Bone Morphogenetic Protein 1/pharmacology , Mesenchymal Stem Cells , Osteoblastoma/complications , Proteomics/methods , Cell Differentiation/genetics , Cloning, Molecular , Electroporation/methodsABSTRACT
Regenerative medicine is a technique to replace or repair defective or diseased tissue or organs by in vitro design with in vivo usage. It can be considered a relatively new branch of medicine born in 1997 when Whithman DH et al. proposed to integrate platelet enriched plasma (PRP) in fibrin glue. In 1998 Marx et al. demonstrated that PRP was able to induce bone regeneration of the jaw. In the same period it was discovered that a fraction of stem cells of bone marrow origin was able to repair several mesenchymal tissues or organs.
Medicina regenerativa é uma técnica de substituir ou reparar defeitos ou tecidos ou órgãos doentes por outros desenhados in vitro para uso in vivo. Estas técnicas podem ser consideradas relativamente novas já que nasceu em bancada em 1997 quando Whithman DH et al propuseram a utilização da cola de fibrina obtida em plasma rico em plaquetas (PRP) para uso terapêutico. Em 1998, Marx et al demonstraram que a PRP foi capaz de induzir regeneração óssea da mandíbula. No mesmo período, foi descoberto que frações de células-tronco de origem na medula óssea foram capazes de reparar tecidos e órgãos a partir de células mesenquimais. O autor faz aqui uma breve revisão do assunto altamente contemporâneo.
Subject(s)
Regenerative Medicine , Plasma , Stem Cells , Blood Platelets , Bone Marrow , Hematopoietic Stem Cells , Fibrin Tissue Adhesive , Mesenchymal Stem Cells , Jaw , MandibleABSTRACT
O sangue de cordão umbilical e placentário (SCUP) é uma rica fonte de células-tronco (CT) hematopoéticas e é amplamente utilizado como substituto da medula óssea em casos de transplante. As células do SCUP possuem vantagens sobre as células da medula óssea (MO), principalmente por serem mais jovens e apresentarem maior taxa proliferativa. Além dos progenitores hematopoéticos, o sangue de cordão umbilical contém progenitores endoteliais e mesenquimais, sugerindo sua possível aplicação nos novos protocolos de terapia celular para diferentes tecidos. Na presente revisão, discutimos a importância do armazenamento do sangue de cordão umbilical autólogo e as pesquisas desenvolvidas para a sua aplicação em doenças degenerativas.
Umbilical Cord Blood is a rich source of hematopoietic stem cells widely used as a substitute of bone marrow (BM) in transplants. Cells from umbilical cord blood present advantages over BM cells, mainly as they are younger and a have higher proliferative rate. Besides hematopoietic stem cells, umbilical cord blood contains endothelial and mesenchymal progenitor cells, suggesting their possible application in cell therapy protocols for different tissues. In this paper, we discuss the importance of autologous umbilical cord blood storage and the research on stem cell transplantation for degenerative diseases.